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病原微生物的檢測(cè)是感染類(lèi)疾病的診斷治療中*的重要環(huán)節(jié)。

      傳統(tǒng)的病原微生物檢測(cè)方法分為培養(yǎng)和非培養(yǎng)兩類(lèi)，臨床*的金標(biāo)準(zhǔn)是分離培養(yǎng)和生化鑒定，這種方法的操作周期長(zhǎng)、失敗率高，并且不是每種病原體都可以培養(yǎng)。相比之下，不依賴(lài)培養(yǎng)的鏡檢、抗體抗原免疫等方法，在采樣當(dāng)天即可報(bào)告結(jié)果。這些方法的時(shí)效性強(qiáng)，但在準(zhǔn)確性上存在明顯劣勢(shì)。

      近年來(lái)，基于核酸檢測(cè)的分子診斷技術(shù)發(fā)展迅速?；?span style="font-family:helvetica neue">PCR的方法直接從樣本中識(shí)別微生物可以加速鑒定，但這些測(cè)試僅包括少量病原體，在選擇測(cè)試之前需要進(jìn)行推定診斷，仍然不能滿(mǎn)足的臨床需要。

然而，大量的重癥感染病例由于不能得到及時(shí)的診斷和治療而延誤病情，造成不可挽回的嚴(yán)重后果。如何才能實(shí)現(xiàn)快速，高效，精準(zhǔn)，無(wú)創(chuàng)，廣譜定性的病原檢測(cè)已成為臨床醫(yī)學(xué)追求的目標(biāo)。

      cfDNA檢測(cè)技術(shù)讓這一希望得以實(shí)現(xiàn)：這種非侵入性診斷技術(shù)目前在在胎兒異常診斷、移植器官排異檢測(cè)及癌癥的表征及檢測(cè)中已得到大量應(yīng)用，而在病原感染檢測(cè)中，cfDNA檢測(cè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)血漿中不同位置感染的病原體DNA的片段檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)檢測(cè)多種感染的可能。

      膿毒癥，一種因感染導(dǎo)致組織和器官損傷，進(jìn)而造成的全身性炎癥反應(yīng)。每年有近3000萬(wàn)人會(huì)感染此類(lèi)疾病，其中超過(guò)1800萬(wàn)為嚴(yán)重病例，800萬(wàn)人會(huì)因此喪生。早期的發(fā)現(xiàn)和適當(dāng)?shù)闹委熢谀摱景Y預(yù)防和控制方面意義重大。

   2019年，著名學(xué)術(shù)期刊《Nature microbiology》報(bào)道了一例利用cfDNA技術(shù)檢測(cè)膿毒癥病原的實(shí)例，工作流程如下圖：

     基于此技術(shù)，病原微生物的臨床可報(bào)告范圍（CRR）有了極大拓展，可包括（1）DNA病毒，可培養(yǎng)細(xì)菌，其他條件苛刻和不可培養(yǎng)的細(xì)菌，分枝桿菌，文獻(xiàn)中的真核病原體；（2）在已發(fā)表的病例報(bào)告中引用的病原體數(shù)據(jù)庫(kù)；（3）從臨床分離測(cè)序獲得的參考基因組以及已報(bào)道的致病性病原。

     這其中，快速精準(zhǔn)以及低微核酸起始量（10pg-100ng）的測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建，得益于Tecan*的Ovation Ultralow Library System V2 文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)，該技術(shù)廣泛適用于各種類(lèi)型的核酸樣本建庫(kù)，尤其在面對(duì)cfDNA檢測(cè)的超低起始量時(shí)表現(xiàn)良好，并能在3小時(shí)內(nèi)完成簡(jiǎn)單，自動(dòng)化的建庫(kù)過(guò)程，并能應(yīng)對(duì)各種GC含量的高保真擴(kuò)增。技術(shù)路線(xiàn)如下：

Ovation Ultralow Library System V2可應(yīng)用于各種類(lèi)型的測(cè)序研究，包括：全基因組測(cè)序、外顯子測(cè)序、ChIP-seq、微生物組研究，液態(tài)活檢，石蠟包埋樣本（FFPE）等。建庫(kù)過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生接頭二聚體（見(jiàn)下圖，與競(jìng)品的比較）。

效果穩(wěn)定，不受核酸起始量影響：

在GC含量的樣本中也能有穩(wěn)定出色的表現(xiàn)：

在《Nature microbiology》的膿毒癥cfDNA病原檢測(cè)研究中，Ovation Ultralow Library System V2大放異彩。研究中利用350名敗血癥患者，166份未發(fā)現(xiàn)明確膿毒癥的樣本開(kāi)展cfDNA的提取，運(yùn)用二代測(cè)序檢測(cè)技術(shù)，鑒別并定量血液中1250種與臨床相關(guān)的細(xì)菌、DNA病毒、真菌和真核寄生蟲(chóng)，可利用血液中游離微生物DNA（cfDNA），準(zhǔn)確、快速地診斷多種感染。

研究中的cfDNA病原微生物檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)高度敏感（靈敏度LoD &小檢測(cè)量 LoQ）的病原微生物檢測(cè),廣譜病原檢測(cè)可報(bào)告范圍使cfDNA病原檢測(cè)技術(shù)具有更廣泛的敏感性：在不用含量血漿DNA檢測(cè)中均有出色表現(xiàn)，結(jié)合臨床驗(yàn)證，125次模擬中有121次正確檢測(cè)，靈敏度達(dá)97%：陽(yáng)性預(yù)a-c測(cè)值（Ppv）達(dá)99%，與預(yù)測(cè)的95%高度一致（圖a-c）；

      該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)病原的精準(zhǔn)檢測(cè)，在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭羞M(jìn)行檢測(cè)精準(zhǔn)度研究發(fā)現(xiàn)，快速檢驗(yàn)測(cè)試中的重復(fù)測(cè)量，個(gè)體微生物的平均變異系數(shù)為21.1%（±13.6%），與實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的檢測(cè)精密度相當(dāng)。

      由于個(gè)體間cfDNA中病原成分的差異，在使用臨床樣本時(shí)難以準(zhǔn)確區(qū)分cfDNA中低水平存在的環(huán)境污染DNA。所以研究利用重復(fù)測(cè)量評(píng)估了這種方法檢測(cè)的分析特異性（下圖）。在被測(cè)試的50件復(fù)制品中，意外的微生物cfDNA僅在一次復(fù)制中檢出，總特異性為98%；以不同比例混入混入菌株檢測(cè)，檢測(cè)值與預(yù)期也保有良好一致性，同時(shí)證實(shí)了密切相關(guān)物種共感染造成的干擾極低。

     為了評(píng)價(jià)血漿來(lái)源的微生物cfdna作為廣泛感染病原體的生物標(biāo)志物的有效性，研究亦將微生物cfDNA測(cè)序結(jié)果與病原體鑒定結(jié)果進(jìn)行了比較（下圖）。與原血培養(yǎng)相比，cfDNA技術(shù)敏感度可達(dá)93.7%，同時(shí)cfDNA技術(shù)提供了物種級(jí)鑒定的靈敏度和速度。

       血液游離微生物DNA測(cè)序，有望作為非侵入性檢測(cè)方法用于感染疾病檢測(cè)。而快速高效高靈敏精準(zhǔn)的建庫(kù)技術(shù)則是臨床病原體檢測(cè)診斷的核心。Ovation Ultralow Library System V2技術(shù)，完美將快速建庫(kù)，低核酸起始量背景，高精準(zhǔn)測(cè)量要求整合，滿(mǎn)足了多種研究和樣本類(lèi)型的建庫(kù)要求，為科學(xué)研究及臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

Analytical and clinical validation of a microbial cell-free DNA sequencing test for infectious disease. Nature microbiology,2019.